Edición Especial No. 6-2005
Salus cum propositum vitae

TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli CON EL GEN cry4A de Bacillus thuringiensis svar. israelensis Y SU EFECTO LARVICIDA SOBRE Aedes aegypti

María Guadalupe Vázquez-Martínez*1,5, Mario H. Rodríguez2, Fidel Hernández-Hernández3, José L. Cabrera-Ponce4 y Jorge E. Ibarra5.

1Centro de Investigación de Paludismo, INSP; Tapachula, Chis., 2Centro de Investigaciones sobre Enfermedades Infecciosas, INSP. Cuernavaca, Mor., 3Depto. de Patología Experimental, CINVESTAV, México, D.F., 4Depto. de Ingeniería Genética de Plantas, CINVESTAV, Irapuato, Gto., 5Depto. de Biotecnología y Bioquímica, CINVESTAV, Irapuato, Gto.

Introducción

Los programas de control de vectores en México se ha enfocado principalmente en controlar las poblaciones de mosquitos con diversos insecticidas químicos (1). Desafortunadamente, el uso constante como medida de control de mosquitos adultos, ha presentado serios problemas. La Organización Mundial de la Salud promueve la sustitución de estos químicos por insecticidas bacterianos, como por ejemplo Bacillus sphaericus y B. thuringiensis. Estos productos han logrado un moderado éxito comercial en países desarrollados, pero su uso es aún reducido en países en desarrollo por sus altos costos (2).

Por otro lado, cabe mencionar que existe una gran diversidad de fuentes naturales de alimento para las larvas de mosquitos, tales como cianobacterias, bacterias, algas y protozoarios (3, 4, 5), lo que amplía la posibilidad de usar estas fuentes para el control larvario de mosquitos, ya que tienen la ventaja de propagarse competitivamente en los hábitats larvales y son una fuente probada de alimento (6, 7). Es por eso que se ha propuesto la introducción de genes que codifiquen las toxinas de algunas bacterias entomopatogenas en algunos de estos organismos que en un momento dado puedan presentarse en el intestino del insecto. El objetivo del presente trabajo se basó en demostrar la actividad larvicida del gen cry4A de B. thuringiensis israelensis, clonado en E. coli, como paso previo a su transferencia a la cianobacteria Phormidium animalis, en larvas del mosquito Aedes aegypti mosquito vector del dengue.

Materiales y Métodos

El gen cry4A fue obtenido a partir del plásmido pHT606, que es el producto de la inserción de un fragmento SstI-SphI de 4.3 kb en el vector pHT315 (8). El plásmido fue amplificado y extraído de la cepa Q2-81 de B. thuringiensis, por el método modificado de  Jensen y colaboradores (9). Dado que el objetivo fue probar la expresión y activación de dicho gen en un vector que permitiera la transformación de la cianobacteria P. animalis, se llevó a cabo una clonación direccional del gen cry4A del pHT606 hacia el plásmido vector pCAMBIA1301, digiriendo en ambos casos con las enzimas SstI–PstI y ligando el fragmento de 4.3 Kb, quedando el gen bajo el control de su propio promotor. Una vez que se obtuvo el vector pCAMBIA1301 conteniendo el gen cry4A (p1301-4A), se transfirió a células de Escherichia coli cepa DH5a por medio de electroporación, para su posterior amplificación y pruebas de actividad tóxica.

Las células transformantes se seleccionaron en medio LB con 50 µg/ml de kanamicina y las colonias que crecieron en las placas fueron aisladas y sembradas en medio líquido LB adicionado con Km, para luego aislar el DNA plasmídico. Las colonias transformantes se caracterizaron por la presencia del plásmido transferido, su tamaño y su análisis de restricción con endonucleasas, por medio de electroforesis en agarosa. La caracterización también incluyó la identificación de un gen del vector (el gen gusA) y el gen de interés (el cry4A) por medio de análisis PCR con iniciadores específicos para ambos genes.

Finalmente, doce colonias seleccionadas fueron sujetas a bioensayos con larvas de tercer estadio del mosquito Ae. aegypti, dispersando una pastilla proveniente de 5 ml de cultivo de las colonias transformantes en 100 ml de agua y agregando 20 larvas. Los bioensayos se realizaron por triplicado y la mortalidad se cuantificó a las 24 hs.

Resultados y Discusión

La subclonación del gen cry4A de B. thuringiensis svar. israelensis en el vector pCAMBIA1301 generó una construcción de 16,104 pb denominada p1301-4A, lo cual fue corroborado por electroforesis en geles de agarosa. Los plásmidos obtenidos de las células recombinantes de E. coli que sobrevivieron a la selección, se sujetaron a un análisis de restricción para identificar al vector mediante el reconocimiento de un fragmento XhoI que codifica para la resistencia a higromicina.

Tabla 1. Mortalidad mostrada por diferentes colonias transformantes de E. coli con el gen cry4A de B. thuringiensis svar. israelensis sobre larvas del mosquito  Aedes aegypti.

Tratamiento

Mortalidad (%)

Tratamiento

Mortalidad (%)

DH5a*

0

Colonia 7

95

Colonia 1

80

Colonia 8

90

Colonia 2

100

Colonia 9

100

Colonia 3

92

Colonia 10

100

Colonia 4

100

Colonia 11

100

Colonia 5

100

Colonia 12

100

Colonia 6

100

PROMEDIO

96.42

                *: Cepa de E. coli sin transformar (testigo negativo).

Se comprobó la presencia de dicho fragmento al observarse una banda a la altura de 1,094 pb (gen hptII) en un gel de agarosa. Adicionalmente, se identificaron a los genes cry4A y gusA en los plásmidos recombinantes, mediante amplificaciones por PCR con iniciadores específicos de éstos, al observarse bandas de 1,529 y 1,200 pb, respectivamente, en geles de agarosa. Por último, se llevaron a cabo un total de 39 bioensayos, correspondientes a las 12 colonias seleccionadas del proceso de transformación, sobre larvas de tercer estadio de Ae. aegypti, cuyos resultados se presentan en la Tabla 1, de acuerdo a éstos, la mayoría de las colonias seleccionadas manifestaron una mortalidad del 100 % o casi ese porcentaje, con excepcion de la colonia 1 donde se registro solo el 80 %, indicando la correcta expresión y activación de la toxina Cry4A clonada. El testigo negativo no mostró mortalidad alguna.

El presente trabajo muestra la efectividad de la proteína Cry4A de B. thuringiensis svar. israelensis, expresada en células de E. coli transformadas con la construcción p1301-4A. Estos resultados indican que el vector pCAMBIA1301, el cual previamente había sido utilizado para generar transformantes de la cianobacteria P. animalis, permitio la expresión apropiada de este gen y hace factible su utilización en la obtención de la cianobacteria recombinante, con capacidad larvicida. Asimismo, estos resultados permiten prever que una combinación de genes cry con capacidad mosquitocida (ej. Cry4B, Cry11A, etc.), podrían similarmente ser expresados y mantener su capacidad insecticida, al ser clonados en este mismo vector. Necesariamente, su expresión y capacidad insecticida deberá ser probada, una vez que esta construcción sea utilizada para transformar a la cianobacteria. Estos trabajos ya se están llevando a cabo en nuestro laboratorio.

Literatura Citada

1.- Méndez, G. J.; A. J. Guerrero, M. M. Pérez y C. R. Quintero. 1984. Evaluación de un esquema alternativo de tratamiento para el control del paludismo. Salud Pública de México 26:561-572.

2.- Porter, A. G.; E. W. Davidson and J. Liu. 1993. Mosquitocidal toxins of Bacilli and their genetic manipulation for effective biological control of mosquitoes. Microbiol. Reviews. 57:838-861.

3.- Thiery, I.; L. Nicolas, R. Rippka and N. Tandeau de Marsac. 1991. Selection of cyanobacterial isolated from mosquito breeding sites as a potential food source for mosquito larvae. Appl. Environ. Microbiol. 57:1354-1359.

4.- Sangthongpitag, K.; S. F. Delaney and P. L. Rogers. 1996. Evaluation of four fresh-water unicellular cyanobacteria as potential hosts for mosquitocidal toxins. Biotechnol. Lett. 18:175-180.

5.- Vázquez-Martínez, M. G.; M. H. Rodríguez, J. I. Arredondo-Jiménez, J. D. Méndez-Sánchez, J. G. Bond-Compeán and M. Gold-Morgan. 2002. Cyanobacteria Associated with Anopheles albimanus (Diptera: Culicidae) larval habitats in Southern Mexico. J. Med. Entomol. 39: 825-832.

6.- Liu, J.-W.; W. H. Yap, T. Thanabalu and A. G. Porter. 1996. Efficient Synthesis of Mosquitocidal Toxins in Asticcacaulis excentricus Demostrates Potential of Gram-negative Bacteria in Mosquito Control. Nat. Biotechnol. 14:343-347.

7.- Porter, A. G. 1996. Mosquitocidal toxins, genes and bacteria: the hit squad. Parasitol. Today. 12:175-179.

8.- Delécluse, A.; S. Poncet, A. Klier and G. Rapoport. 1993. Expression of cryIVA and cryIVB Genes, Independently or in Combination, in a Crystal-Negative Strain of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Appl. Environ. Microbiol. 59:3922-3927.

9.- Jensen, G. B.; A. Wilcks, S. S. Petersen, J. Damgaard, J. A. Baum and L. Andrup. 1995. The genetic basis of the aggregation system in Bacillus thuringiensis subsp. israelensis is located on the large conjugative plasmid pX016. J. Bacteriol. 177:2914-2917.

Palabras Clave: B. thuringiensis, cry4A, Aedes aegypti.

 



Revista de la Facultad de Salud Pública y Nutrición
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